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Nov 18, 2023

Neuer Höchststand

Das innovative Laserscanning-Design ermöglicht höchste Präzision

Das innovative Laserscanning-Design ermöglicht hochpräzise Beobachtungen mit bis zu 10.000 Bildern pro Sekunde und macht das Mikroskop zu einem leistungsstarken Aufnahmewerkzeug

SPIE – Internationale Gesellschaft für Optik und Photonik

Bild: Durch die Kombination zweier Laserscan-Modi haben Forscher ein vielseitiges Zwei-Photonen-Mikroskopiesystem entwickelt, mit dem sich extrem schnelle biologische Prozesse mit hohen Bildraten und räumlicher Auflösung beobachten lassen.mehr sehen

Bildnachweis: Li et al., doi 10.1117/1.NPh.10.2.025006.

Die Zwei-Photonen-Mikroskopie (TPM) hat das Gebiet der Biologie revolutioniert, indem sie es Forschern ermöglicht, komplexe biologische Prozesse in lebenden Geweben mit hoher Auflösung zu beobachten. Im Gegensatz zu herkömmlichen Techniken der Fluoreszenzmikroskopie nutzt TPM niederenergetische Photonen, um fluoreszierende Moleküle zur Beobachtung anzuregen. Dies wiederum ermöglicht ein wesentlich tieferes Eindringen in das Gewebe und stellt sicher, dass die fluoreszierenden Moleküle, sogenannte Fluorophore, durch den Anregungslaser nicht dauerhaft geschädigt werden.

Einige biologische Prozesse sind jedoch selbst mit modernen TPMs einfach zu schnell, um erfasst zu werden. Einer der Designparameter, der die Leistung eines TPM begrenzt, ist die Zeilenabtastfrequenz, gemessen in Bildern pro Sekunde (FPS). Dies bezieht sich auf die Geschwindigkeit, mit der die Zielprobe vom Anregungslaser in einer Richtung überstrichen werden kann (z. B. bei einer horizontalen Bewegung). Eine langsame Scanfrequenz wirkt sich auch auf die Gesamt-FPS des Systems aus, da sie bestimmt, wie schnell der Laser in die andere Richtung, also in einem vertikalen Sweep, bewegt werden kann. Zusammen ergeben diese einen Kompromiss zwischen der zeitlichen Auflösung des Mikroskops und der Größe des Beobachtungsrahmens.

Um dieses Problem zu umgehen, hat ein internationales Forscherteam aus China und Deutschland kürzlich einen leistungsstarken TPM-Aufbau mit einer beispiellos hohen Zeilenscanfrequenz entwickelt. Laut ihrem in Neurophotonics veröffentlichten Bericht wurde dieses Mikroskopiesystem für die Abbildung schneller biologischer Prozesse mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung entwickelt.

Einer der Schlüsselfaktoren, die das vorgeschlagene TPM von herkömmlichen unterscheiden, ist die Verwendung von akusto-optischen Deflektoren (AODs) zur Steuerung der Abtastung des Anregungslasers. Ein AOD ist ein spezieller Kristalltyp, dessen Brechungsindex durch akustische Wellen präzise gesteuert werden kann. Dies wiederum ermöglicht es uns, einen Laserstrahl nach Wunsch umzulenken. Noch wichtiger ist, dass AODs eine schnellere Lasersteuerung ermöglichen als die Galvanometer, die in herkömmlichen TPMs verwendet werden.

Dementsprechend entwarf das Team einen maßgeschneiderten AOD mit einer außergewöhnlich hohen Schallgeschwindigkeit unter Verwendung eines Tellurdioxid-Kristalls (TeO2), der eine hohe Zeilenabtastfrequenz erreichte. Mit diesem AOD könnte der Laser eine Zeile im Bild innerhalb von nur 2,5 Mikrosekunden scannen, was einer maximalen Zeilenscanfrequenz von 400 kHz entspricht. In ähnlicher Weise verwendete das Team einen AOD, um eine angemessen langsame Scanfrequenz in die andere Richtung zu erreichen.

Um die Anpassungsfähigkeit ihres Mikroskops weiter zu verbessern, fügte das Team die Option hinzu, bei Bedarf auf einen Galvanometer-basierten Laserscanmechanismus umzusteigen. Dies ermöglichte das Scannen großer Bereiche der Probe mit einer akzeptablen Auflösung und Geschwindigkeit, wodurch es einfacher wurde, kleine Bereiche von Interesse zu lokalisieren, bevor auf das AOD-Scannen umgestellt wurde.

Das Team führte mehrere Proof-of-Concept-Experimente mit dem neu entwickelten TPM durch. Sie installierten Schädelfenster in gentechnisch veränderten Mäusen und beobachteten damit die Morphologie und Aktivität von Neuronen sowie die Bewegung einzelner roter Blutkörperchen (RBCs). Bei entsprechender AOD-Konfiguration und Bildgröße erreichte das System eine Bildrate von bis zu 10.000 FPS. Dies reichte aus, um die Geschwindigkeit, mit der sich Kalzium in neuronalen Dendriten ausbreitet, genau zu messen und die Flugbahn einzelner Erythrozyten in Blutgefäßen zu visualisieren.

Beeindruckt von diesen Ergebnissen bemerkt Dr. Na Ji, Mitherausgeber von Neurophotonics und Luis Alvarez Memorial Chair für Experimentalphysik an der UC Berkeley: „Das neue System für die AOD-basierte Rastermikroskopie stellt, wie gezeigt, eine erhebliche Verbesserung der Bildgebungsgeschwindigkeit und -leistung dar.“ in seiner Anwendung zur Ausbreitung von Kalziumsignalen und zur Messung des Blutflusses im Gehirn in vivo.

Künftig wird das neue Proof-of-Concept-TPM-Design die Erfassung schneller biologischer Prozesse ermöglichen und könnte unser Verständnis dieser Prozesse erheblich verbessern.

Lesen Sie den Gold Open Access-Artikel von Li et al., „Ten-kilohertz two-photon microscopy imaging of single-cell dendriticactivity and hemodynamics in vivo“, Neurophotonics10(2), 025006 (2023), doi 10.1117/1.NPh.10.2.025006.

Neurophotonik

10.1117/1.NPh.10.2.025006

Zehn-Kilohertz-Zwei-Photonen-Mikroskopie-Bildgebung der dendritischen Aktivität und Hämodynamik einzelner Zellen in vivo

3. Mai 2023

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